肝細(xì)胞肝癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）是常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大常見原因。近年來，特別是亞洲國家的發(fā)病率和病死率有所增加。雖然手術(shù)切除和肝移植是治療ＨＣＣ的主要方法，但大多數(shù)患者明確診斷時已處于ＨＣＣ晚期，失去手術(shù)機(jī)會，導(dǎo)致預(yù)后較差。雖然ＨＣＣ與多種表觀遺傳學(xué)和遺傳學(xué)改變有關(guān)，但其發(fā)病的潛在分子機(jī)制尚不清楚，缺乏有效的生物標(biāo)志物，嚴(yán)重制約著ＨＣＣ的早期診斷、預(yù)后評估和治療。microRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼?。遥危练肿?，由２２個核苷酸組成，其主要功能是能夠通過與靶ｍＲＮＡｓ的３′－ＵＴＲ結(jié)合，抑制靶ｍＲＮＡｓ的翻譯或剪切，從而對靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。miRNAs與多種人類癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，多種ｍｉＲＮＡ在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中異常表達(dá)，這種異常的表達(dá)可以作為肝癌早期診斷、預(yù)后評估和治療的有效靶點(diǎn)［１］。ｍｉＲ－１２２作為miRNAs家族的重要一員，其在肝癌進(jìn)程中的作用機(jī)制受到人們的關(guān)注。有研究表明，miR-122可以通過影響絲氨酸／蘇氨酸激酶、細(xì)胞周期蛋白Ｇ１途徑抑制腫瘤進(jìn)展，但是目前這些研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能解釋miR-122抑制腫瘤進(jìn)展的作用機(jī)制，致使對miR-122功能的研究受到了很大的限制。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-122可能的靶基因，并應(yīng)用雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)及Westernblot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，確定miR-122在肝癌細(xì)胞中的靶基因，進(jìn)一步行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR-122及其靶基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生物活性的影響，旨在為深入研究ｍｉＲ－１２２在ＨＣＣ進(jìn)程中的作用機(jī)制提供研究線索，并為臨床探索ＨＣＣ早期診斷、治療ＨＣＣ的有效途徑提供可靠依據(jù)。

miR-122靶基因的生物信息學(xué)分析應(yīng)用生物信息學(xué)軟件microRNA.org、TargetScan和miRanda預(yù)測miR-122的可能的靶基因。

肝癌細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株ＳＭＭＣ７７２１和Ｈｅｐ３Ｂ購自中國科學(xué)院。肝癌細(xì)胞株正常傳代并維持于含有１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培養(yǎng)基中，于含有５％ＣＯ２的３７℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)將ＬＭＮＢ２ＵＴＲ的野生型和突變體插入熒光素酶下游，分別構(gòu)建ｐＧＬ３－ＬＭＮＢ２ＵＴＲＷＴ和ｐＧＬ３－ＬＭＮＢ２ＵＴＲＭｕｔ質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染到ＳＭＭＣ７７２１細(xì)胞中，同時在ＳＭＭＣ７７２１細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-122ｍｉｍｉｃｓ。使用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。并應(yīng)用腎熒光素酶活性對結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

Westernblot實(shí)驗(yàn)將對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞株Ｈｅｐ３Ｂ和ＳＭＭＣ７７２１接種于６孔板中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞株生長至８０％時，分別轉(zhuǎn)染miR-122ｍｉｍｉｃｓ和miR-122ＡＳＯ，各組均設(shè)立空白對照。繼續(xù)培養(yǎng)４８ｈ后每孔加入ＲＩＰＡ裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，４℃環(huán)境作用３０ｍｉｎ，收集上清定量，然后按比例與上樣緩沖液混勻，１００℃煮５ｍｉｎ后放置１０ｍｉｎ，應(yīng)用１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ進(jìn)行電泳，并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。應(yīng)用５％脫脂牛奶封閉２ｈ，加入ＬＭＮＢ２抗體（１∶１０００）和β－ａｃｔｉｎ抗體（１∶５０００），４℃過夜，應(yīng)用ＴＢＳＴ洗滌。加入抗兔抗體（１∶２５００），室溫下孵育１ｈ，加入發(fā)光試劑，于暗室曝光、壓片、顯影、定影。測定靶基因條帶亮度值，繪制柱狀。

針對目前的研究現(xiàn)狀，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-122的靶基因，并應(yīng)用熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)和Westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-122對靶基因的調(diào)控作用。然后應(yīng)用菌落形成試驗(yàn)和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分析靶基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生物活性的影響。最終發(fā)現(xiàn)ＬＭＮＢ２是miR-122的下游靶基因；miR-122可降低肝癌細(xì)胞中ＬＭＮＢ２的表達(dá)；在肝癌細(xì)胞Ｈｅｐ３Ｂ中過表達(dá)ＬＭＮＢ２可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；在肝癌細(xì)胞ＳＭＭＣ７７２１中抑制ＬＭＮＢ２表達(dá)，可降低肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。總之，miR-122可以通過靶定ＬＭＮＢ２抑制肝癌細(xì)胞的生物活性，其可以作為肝細(xì)胞肝癌早期診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。