銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa) 又稱綠 膿桿菌，屬于 γ－變形菌綱假單胞菌科，是一種在自然 界中廣泛存在的條件性致病菌。銅綠假單胞菌 生存能力極強，能在各種環(huán)境中存活，并在機體免疫 功能低下或受損時引發(fā)感染，可引起人體燒傷或 創(chuàng)傷部位的傷口感染、中耳炎、角膜炎、肺炎甚至敗血 癥; 奶牛或奶羊乳房炎; 水貂出血性肺炎; 雛雞敗血癥; 仔豬腹瀉等疾病。近年來，銅綠假單胞菌抗 生素耐藥問題日趨嚴(yán)重，因此疫苗研發(fā)再次成為國內(nèi) 外學(xué)者研究的熱點。2000 年，完成了銅綠假單 胞菌 PA01 菌株基因組測序，從而為認(rèn)知該物種的復(fù) 雜性提供了幫助。

1 材料

1. 1 試驗動物

清潔級 ICＲ 品系小白鼠 105 只，雌性，體重為 18 ～ 22 g; 清 潔 級 豚 鼠 15 只，雌 性，體 重 為 250 ～ 350 g; 均購自黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1. 2 藥品

0. 9%氯化鈉注射液，購自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司。

1. 3 主要試劑

銅綠假單胞菌內(nèi)毒素蛋白、類毒素( 由外毒素 A 脫毒制備) 、外膜蛋白樣品及內(nèi)毒素蛋白陽性血清、 類毒素陽性血清、外膜蛋白陽性血清和陰性血清，由 中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業(yè)實驗 室提供; PBST 緩沖液，購自上海莼試生物技術(shù)有限公 司; 牛血清白蛋白，購自鹽城賽寶生物科技有限公司; 辣根過氧化物酶標(biāo)記的SPA，購自上?？茀R生物技術(shù)有限公司; 鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司; 硫 柳汞鈉，購自上海信裕生物科技有限公司。

1. 4 主要儀器

生物安全柜( 型號為 CLASS Ⅱ TYPE A2) ，購自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司; 電熱恒溫培養(yǎng)箱 ( 型號為 DNP－9082) ，購自上海精宏實驗設(shè)備有限公 司; 獨立送風(fēng)隔離籠具( 型號為 IVC－II) ，購自蘇州馮 氏實驗動物設(shè)備有限公司; 多功能酶標(biāo)儀( 型號為 Infinite M200 PＲO) ，購自瑞士 Tecan 公司。

2 方法

2. 1 內(nèi)毒素蛋白、類毒素和外膜蛋白抗體效價的檢測

取銅綠假單胞菌內(nèi)毒素蛋白、類毒素和外膜蛋 白，在百級潔凈條件下以 0. 9%氯化鈉注射液分別制 備成 0. 4 mg /mL 的溶液，加入終濃度為 0. 01%的硫 柳汞鈉，混合均勻后用 0. 22 μm 濾器過濾，分裝成針 劑，4. 3 mL /安瓿。 取 32 只小白鼠，將其分成 4 組，每組 8 只，其中 3 組分別用上述 3 種蛋白針劑腹部皮下免疫小鼠，首 免 0. 1 mL，二免 0. 2 mL，三免 0. 3 mL，每次間隔 3 d。 剩余 1 組為 0. 9%氯化鈉注射液對照組，免疫時間及 劑量與另 3 組相同。 免疫前小鼠斷尾采血，首免后每間隔 7 d 采血， 共采血 7 次，4 ℃、4 000 r /min 離心 10 min 收集血 清。間接 ELISA 法測定血清抗體水平，參照殷州 的方法。1) 包被抗原 100 μL /孔，4 ℃ 過夜后棄去孔 內(nèi)液體，用 pH 值 7. 4 PBST 洗滌 2 次，每次 5 min，在 濾紙上拍干; 0. 5% BSA 200 μL /孔封閉，37 ℃ 作用 1. 5 h; 用 pH 值為 7. 4 的 PBST 洗滌 3 次，每次 5 min， 在濾紙上拍干; 加血清 100 μL /孔，37 ℃ 作用 1 h，每 孔做 3 個重復(fù)，洗滌 3 次; 加辣根過氧化物酶標(biāo)記的 SPA( 用 PBST 稀釋) 100 μL /孔，37 ℃ 作用 1 h，洗滌 4 次。2) 加底物溶液 100 μL /孔，37 ℃ 反應(yīng) 15 min; 加 2 mol /L 硫酸 100 μL /孔; 在 450 nm 波長處測定每 孔 OD 值。 按上述步驟建立的間接 ELISA 方法，對對照組 的8 份陰性血清進行檢測，每份樣品重復(fù) 3 孔，結(jié)果 取平均值，計算樣品 OD450值，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn) 差”表示。

2. 2 內(nèi)毒素蛋白、類毒素和外膜蛋白內(nèi)毒素含量的測定

按照《中華人民共和國藥典》( 2015 年版) 中規(guī) 定的方法進行試驗。

2. 2. 1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定

細(xì)菌內(nèi)毒素限值 ( L) = K/M，式中 K 為人每千克體重每小時最大可接受 的內(nèi)毒素劑量，單位為 EU/( kg·h) ; M 為人每千克體重 每小時的最大供試品劑量，單位為 mg /( kg·h) ?！吨腥A 人民共和國藥典》( 2015 年版) 中規(guī)定，注射劑 K = 5 EU/( kg·h) ; 3 種蛋白每次最大注射劑量為 0. 12 mg， 人均 體 重 按 60 kg 計 算，注 射 時 間 為 1 min，M = 0. 12 mg /60 kg× 1/60 h = 0. 12 mg /( kg·h) ，則 L = 5 ［EU/( kg·h) ］/0. 12 ［mg /( kg·h) ］= 41. 67 EU/mg。

3 結(jié)果與分析

采用間接 ELISA 法檢測 3 種蛋白免疫組和對照 組小鼠血清抗體水平，結(jié)果 3 種蛋白免疫后小鼠血清 抗體效價均隨免疫進程持續(xù)升高，免疫組與對照組差 異顯著( P＜0. 05) ，見表 1。


4 結(jié)論

銅綠假單胞菌內(nèi)毒素蛋白免疫原性很好，但內(nèi)毒 素含量略高，以其作為疫苗的主要成分會有一定的不 良反應(yīng); 外毒素 A 經(jīng)甲醛脫毒而成的類毒素和外膜 蛋白的免疫原性也較好，且內(nèi)毒素含量較低，因此本研究測定了內(nèi)毒素蛋白、類毒素和外膜蛋白的免疫原 性和內(nèi)毒素含量，制備了 5 組混合蛋白疫苗。研究表 明: 3 號混合蛋白疫苗的免疫效果與內(nèi)毒素蛋白持 平，估計是 3 種抗原組分聯(lián)合免疫后對機體的免疫系 統(tǒng)產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，而且 3 號混合蛋白疫苗內(nèi)毒素含量低于內(nèi)毒素蛋白，有希望成為一種免疫效果好、不 良反應(yīng)少的銅綠假單胞菌疫苗。