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豬卵泡顆粒細(xì)胞表型分析?。?!

返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2021-03-29 08:55【

    探討干擾和過表達(dá)BAMBI基 因?qū)ωi卵泡顆粒細(xì)胞的表型和功能的影響以及其對(duì) TGF-β通路下游相關(guān)基因及凋亡基因的表達(dá)調(diào)控, 為解析豬卵泡發(fā)育和排卵數(shù)量調(diào)控機(jī)理提供依據(jù)。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、無毒素質(zhì)粒小提/ 大提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、酵 母提取物、胰蛋白胨均購自天根生化科技(北京)有 限公司;限制性內(nèi)切酶 NotⅠ、BamHⅠ和 EcoRⅠ、 T4DNA 連接酶和 RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自寶生 物工程(大連)有 限 公 司;總 RNA 提取試劑盒購自 上海普洛麥格生物制品有限公司;氨芐青霉素購自 哈爾 濱 制 藥 六 廠;Lipofectamine2000 和 DMEM/ F12均購 自 英 杰 生 命 技 術(shù) 有 限 公 司;青 霉 素 購 自 Amresco公司;AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測 試劑盒購自 CST 公司。 超凈工作臺(tái)購自上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠;超低溫 冰箱(-80 ℃)和臺(tái)式 高 速 離 心 機(jī) 均 購 自 賽 默 飛 世 爾 科 技 公 司;CyclerTM ThermalCyclerPCR 儀、儀均購自Bio-Rad公司;DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng) 箱和 DKB-5-1A 型超恒溫水浴鍋均購自上海精宏實(shí) 驗(yàn)設(shè)備有限公司;DHG-9240AS型電熱恒溫鼓風(fēng)干 燥箱購自寧波東南儀器有限公司;MO-2270MI(N) 微波爐購自青島海爾制品有限公司。

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    利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法 檢 測 卵 泡 顆 粒 細(xì) 胞過表達(dá)和 干 擾 BAMBI后,TGF-β信 號(hào) 通 路 中 下 游基 因(TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、SMAD1、SMAD2、 SMAD3、SMAD4、SMAD5)和 細(xì) 胞 凋 亡 基 因(Bax、 Bcl-2)mRNA 的 表 達(dá) 水 平,以 GAPDH 為 內(nèi) 參 基 因。根據(jù) NCBI公布的豬基因編碼區(qū),利用 Primer Premier5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物,送生工 生物工程(上海)股份有限公司合成,PCR 反 應(yīng) 體 系 25μL:cDNA 模 板 1μL, SYB Green Mix 染 料 12.5 μL,上、下 游 引 物 (10μmol/L)各1μL,ddH2O9.5μL。實(shí)時(shí)熒光定 量 PCR 反 應(yīng) 程 序:95 ℃ 預(yù) 變 性 5 min;95 ℃ 變 性 10s,退火(具體溫度見表2)20s,72℃延伸10s,共 45個(gè)循環(huán);72℃延伸4min;4℃保存。試驗(yàn)對(duì)所有 樣本均進(jìn)行3個(gè)重復(fù)測定,并在每次試驗(yàn)時(shí)用同體 積的無菌水作為陰性對(duì)照。





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